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技术资料/正文
细胞复苏传代冻存步骤.docx
798 人阅读发布时间：2024-08-05 16:06
- 所需仪器：
生物安全柜
电动移液器
CO2培养箱
倒置显微镜
液氮罐
恒温水浴锅
-86℃超低温冰箱
- 所需试剂：
无菌1×PBS pH=7.2
完全培养基
消化液：0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA
完全培养基（含血清）
细胞培养级DMSO
冻存液：80%FBS+20%DMSO
无菌1×PBS pH=7.2
消化液：0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA
异丙醇
- 所需耗材：
T-25细胞培养瓶
一次性无菌移液管（2ml、5ml、10ml）
1.8ml冻存管
程序降温盒
- 复苏操作步骤：
- 将恒温水浴锅中的水预热到37℃；
- 从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入恒温水浴锅中复温，工程中需要不断震荡冻存管以提高复温速率；
- 将融化了的冻存管中的用移液管转入一直装有5ml完全培养基的15ml离心管中，充分混匀后，300g离心5min；
- 传代操作步骤：
- 将需要那传代的细胞从CO2培养箱中取出，在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，吸弃瓶内的培养基；
- 向培养内加入无菌1×PBS 3ml，之后水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使PBS能够浸润到培养平面上所都的面积，吸弃PBS；
- 重复步骤2一次，之后向瓶内加入消化液1ml，轻微震荡后放入37℃CO2培养箱中孵育2-4min；
- 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，如还有部分细胞为消化下来，可在生物安全柜内用移液管吸起消化液，吹打培养平面；
- 向消化下细胞的培养瓶中加入1ml含血清的完全培养基终止消化，然后将培养瓶中的液体转入15ml离心管中，300g离心5min；
- 离心完成后，弃上清，用2ml完全培养基重悬细胞，将重悬后的培养基转入2个T-25培养瓶，每个培养瓶各1ml，再向每个培养瓶中各加入4ml完全培养基；
- 水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使细胞均匀分部在培养平面上，然后将培养瓶置于CO2培养箱中静置培养。
- 冻存操作步骤：
2.向培养内加入无菌1×PBS 3ml，之后水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使PBS能够浸润到培养平面上所都的面积，吸弃PBS；
3.重复步骤2一次，之后向瓶内加入消化液1ml，轻微震荡后放入37℃CO2培养箱中孵育2-4min；
4.孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，如还有部分细胞为消化下来，可在生物安全柜内用移液管吸起消化液，吹打培养平面；
5.向消化下细胞的培养瓶中加入1ml含血清的完全培养基终止消化，然后将培养瓶中的液体转入15ml离心管中，300g离心5min；
6.离心完成后，弃上清，用0.5mlFBS重悬细胞，再加入0.5ml冻存液，用移液管充分混匀，之后转入1.8ml冻存管中；
7.将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
8.第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。