经常在网上看到很多人为了如何正确分离培养原代细胞而多方求救，也不乏高人不吝赐教，相关可查的文献也不少，但是各式各样的疑问还是层出不穷。

恰好我们的团队每天都在跟细胞打交道，也遇到过很多人正面临的问题，于是有了下面这些心得体会，如若能给你带来哪怕一丝一毫的帮助，愿你转发。

原代细胞分离常采用的方法有以下两种：

一、悬浮细胞的分离方法

1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/min 的低速离心 5 分钟；

2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的 PBS 清洗后 1000rpm/min 离心 5 分钟。此步重复两次；

3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养；

4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。

二、机械分散法

适合的组织：纤维成分很少的脑组织、部分胚胎组织、以及一些肿瘤组织等，但是这一方法对组织的损伤较大。

过程：用 PBS 清洗两次后，

（1）剪刀剪碎切后用吸管反复吹打，分散组织细胞；

（2）将已充分剪碎分散的组织放在注射器内 （用九号针），使细胞通过针头压出；

（3）或在不锈钢纱网内用钝物压挤 （常用注射器钝端） 使细胞从网孔中压挤出。

原代细胞培养最基本和最常用的是组织块法和消化法组织块培养：处死动物，无菌取组织块入校烧杯内，用尖嘴眼科剪刀将组织块剪碎，吸管吸取 PBS 液冲下剪刀上的碎片，补加 PBS,用吸管轻轻吹打，低速离心，弃去上清液，留下组织块，然后接种于培养瓶。

消化培养：用消化液将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使组织松散、细胞分散形成悬液。

消化过程中常用的消化液：

1、胰蛋白酶

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。

在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用能力最强。

2、胶原酶

胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。

胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。

胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。

a、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动细胞的分离；

b、胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织；

c、胶原酶Ⅳ包含至少 7 种蛋白酶成分，分子量从 68-130KD 不等。它能消化多种组织；

d、胶原酶Ⅴ包含至少 7 种蛋白酶成分，分子量从 68-130KD 不等。它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。

下面让我们举几个实例：

正常大鼠心肌成纤维细胞培养（组织块法）：

1、将取出的心脏组织至于无菌的培养皿中用含双抗的 1×PBS（pH=7.4）清洗若干次至无明显血细胞；

2、剪开心脏组织的心房和心室部分，用含双抗的 1×PBS（pH=7.4）清洗若干次以去除心脏内部的大部分血液；

3、将清洗好的心脏组织剪成 2 mm3 大小，加入含双抗的 1×PBS（pH=7.4）清洗；然后转入 15 ml 离心管，300r/min，离心 3 min 后弃上清液。重复 2-3 次，直至离心后的液体中观察不到明显的红色。

4、将清洗好的组织块重新转至无菌的培养皿中，用无菌的 200 ml 的吸头将组织块贴于 T-25 培养瓶中；

5、加入 2 ml 培养基，将培养瓶倒置放于 37℃、5% CO₂ 的培养箱中 2-3 h 之后，翻转培养瓶，继续培养。

大鼠肾小管上皮细胞培养（消化法）：

1、无菌条件下摘取大鼠肾脏，于盛有含双抗的 1×PBS（pH7.4）的培养皿中冲洗，用眼科剪将肾脏被膜充分剥离。

2、去掉肾髓质，切取外层皮质于培养皿中，并用眼科剪将其剪碎至 1 mm3 左右大小。

3、用含双抗的 1×PBS（pH7.4）充分冲洗 2-3 次。

4、肾小管节段至离心管中离心 300rpm 3 min.

5、弃上清，沉淀加入 0.25% 胰蛋白酶，置于 37℃ 水浴锅中消化 20 min.

6、加入 1 mlFBS 终止反应。

7、取上清液，过 200 目网筛后收集液体，于 1000rpm 离心 5 min.

8、弃去上清，收集沉淀，加入培养基进行细胞重悬。

9、将细胞以合适的数量接种于培养瓶中。

10、将细胞放入 37℃，5% CO₂ 培养箱内培养，并于 72 h 后进行首次换液，以后每 48 h 换一次液，直至细胞汇合铺满整个培养瓶。

当然，实际操作过程中，有时候一些细微的疏忽或差异都有可能影响到细胞的状态。我们很多人都遇到过这样的情况，当你花了很多心血分离或培养一瓶原代细胞，到了关键时刻它却弃你而去，丝毫不管不顾你的论文截止时间已经近在眼前，当你欲哭无泪肝肠寸断的时候，请不要忘了你还可以直接从专业机构购买原代细胞。目前市面上已经有不少提供优质原代细胞的专业技术企业，有些还提供配套的技术服务，不失为一个解决问题的好途径。

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