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赛百慷(上海)生物技术股份有限公司(iCellBioscience,Inc.)是一家专注于高品质原代细胞、细胞株/系、iPS细胞产品的研发和生产,并提供专业的技术外包服务的高新生物技术企业,总部位于上海。赛百慷( ... [详细介绍]

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赛百慷 || 小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法

发布时间:2018-11-21 10:08 点击次数:

海马体主要负责记忆和学习,日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起,由细胞体和细胞突起构成。
小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织,因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性,具有不能传代,不能增殖等特点,所有收到细胞后尽快使用。

为了更好的服务于广大科研工作者,赛百慷技术人员特提供了海马神经元细胞分离培养方法,技术因人而异仅供参考:

1.试验所需仪器设备及试剂

(1)仪器

生物安全柜

CO2细胞培养箱

荧光倒置显微镜

高速冷冻离心机

电热恒温鼓风干燥箱

(2)试剂耗材

T25细胞培养瓶

血球计数板

细胞培养孔板

红细胞裂解液

神经元完全培养基

0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)

多聚jia醛(PFA)

DAPI

Triton X-100

山羊血清

NSE

Goat anti-Rabbit lgG(H+L)

Cross-Adsorbed Secondary antibody,Alexa Fluor 594

Fluoromount-G荧光封片剂

2.分离培养方法

1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡,

2) 在冰浴的PBS中分离海马,PBS洗涤3次,剪碎,

3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min,

4) 用FBS终止消化,轻轻吹打,

5) 过100 μm 滤网,

6) 收集滤液,300 g离心5 min,

7) 用完全培养基重悬沉淀,铺瓶。

3.免疫荧光

3.1.实验步骤

(1)细胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中,每孔加入培养基1mL,加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

2)固定

细胞爬片后,吸出培养基,用PBS洗1遍,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS,放4℃过夜。

(3)破膜封闭

将玻片除去水分,置于培养皿支撑物上,

玻璃片封闭液配置:0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合,再加10% 血清,

取50uL破膜封闭液滴于防水膜上,将玻片上有细胞的一面盖上2h。

4)一抗孵育

一抗配制:抗体与PBS 1:100(200)稀释

破膜封闭后,取50uL一抗于防水膜上(湿盒中),将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)

(5)二抗孵育

室温避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,PBS洗3×5min/次。

6)包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G,将有细胞的一面盖上。

鉴定细胞为P1代细胞

3.2.检测结果

(1)细胞免疫荧光鉴定照片

阴性

          100X-DAPI                                 100X-Fluorescence

NSE

        100X-DAPI                                      100X-Fluorescence

(2)检验基本情况:

经免疫荧光鉴定,该细胞纯度达到90%以上。

除了上述的细胞分离方法以外,赛百慷还有很多关于其他细胞的分离方法,想要学习的小伙伴可以来赛百慷进行现场学习,如果想要其他原代分离培养方法,可打电话或咨询相关工作人员。