永生化细胞构建方法 || 山羊乳腺上皮细胞永生化构建方法

       山羊乳腺上皮细胞来源于实验动物正常乳腺组织，乳腺小叶中，它们与腺体导管和脂肪组织一起在乳腺中形成复杂的网络结构，乳腺位于皮下浅筋膜的浅层与深层之间。浅筋膜伸向乳腺组织内形成条索状的小叶间隔，一端连于胸肌筋膜，另一端连于皮肤，将乳腺腺体固定在胸部的皮下组织之中。乳房腺体由15-20个腺叶组成，每一腺叶分成若干个腺小叶，每一腺小叶又由10-100个腺泡组成，这些腺泡紧密地排列在小乳管周围，腺泡的开口与小乳管相连。

       乳腺上皮细胞在人和动物体出生、发育和妊娠中均会受荷尔蒙调控而进行一系列的增长、迁移和分化。激素水平失调、细胞外基质的变化和其它的基因因素都会导致乳腺上皮细胞恶性增长，最终导致乳腺癌的发生。了解乳腺上皮细胞的特性可以帮助我们理解乳腺癌的病例机制以及为治疗确定新的靶点。

       该细胞通过慢病毒转染的方式携带SV40基因（转染后此细胞带有嘌呤霉素抗性）。

       细胞鉴定通过广谱角蛋白（PCK）或角蛋白Cytokeratin免疫荧光染色为阳性，细胞鉴定纯度高于90%，不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌，呈现为上皮样，多角形细胞，细胞培养方式为贴壁培养。培养该永生化细胞要使用山羊乳腺上皮细胞永生化细胞专用培养基（iCell-0016a-001b）。

       以下是永生化细胞使用的设备、试剂及分离培养构建方法，仅供参考：

1.试验所需仪器设备及试剂

（1）仪器

（2）试剂耗材

2．山羊乳腺上皮细胞的培养

a) 客户提供细胞，复苏，培养，

细胞状态如下：

                           100x                                                             200x

原图见文件-细胞培养

3．免疫荧光鉴定

3.1实验步骤

（1）细胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

（2）固定

细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。

（3）破膜封闭

将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，

玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，

取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。

（4）一抗孵育

一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释

破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）

（5）二抗孵育

室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。

（6）包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。

3.2免疫荧光鉴定结果

                      100X-DAPI                                                   100X-fluorescence 

                    200X-DAPI                                               200X-fluorescence

原图见文件-免疫荧光

4.转染

4.1SV40过表达慢病毒基本信息

4.2转染

（1）将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1×105 个，

（2）第二天，待细胞贴壁后，换液，

（3）加入1mL完全培养基，再加20 μL SV40过表达慢病毒，

（4）混匀后继续培养，

（5）12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，

（6）当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中。

5.筛选

5.1杀灭曲线的确定

（1）将未转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜，

（2）第二天，除去24孔板中旧的培养基，

（3）将含不同浓度嘌呤霉素（1ug/mL，2ug/mL，3ug/mL，4ug/mL，5 ug/mL，6ug/mL，7ug/mL）的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板，

（4）每2天更换新鲜的筛选培养基，

（5）每天观察细胞的存活比例，

（6）最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。

  结果：嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为3d。

5.2嘌呤霉素筛选转染细胞

（1）第一天，将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜

（2）第二天，除去24孔板中旧的培养基，

（3）加入含嘌呤霉素（2ug/mL）的筛选培养基，孵育，

（4）每2天更换新鲜的筛选培养基，

（5）每天观察细胞的存活比例，

（6）在同一时间点（3d）存活的细胞，即为转染成功的细胞，

（7）对筛选后的细胞进行扩增。

6.细胞扩增

将筛选后的细胞进行扩增，筛选后的细胞为P1代，扩增至少到12代。

下图为永生化P11代细胞

                             100x                                                              200x

原图见文件-永生化

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