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赛百慷(上海)生物技术股份有限公司(iCellBioscience,Inc.)是一家专注于高品质原代细胞、细胞株/系、iPS细胞产品的研发和生产,并提供专业的技术外包服务的高新生物技术企业,总部位于上海。赛百慷( ... [详细介绍]

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培养脐带间充质干细胞的新方法——胶原酶消化法【原创】

发布时间:2018-09-03 14:20 点击次数:

       脐带间充质干细胞具有高度分化潜能,基因稳定、不易突变,不会引起肿瘤;无需配型、无排异,广泛应用于疾病治疗及抗衰老研究。目前,在美容行业及针对亚健康群体的应用,也越来越引人注目。

       脐带间充质干细胞脐带是由包膜、华通氏胶、脐静脉、脐动脉脐构成。脐带间充质干细胞存在于华通氏胶中。
       由于存在数量少,用胶原酶消化后获取的细胞量很少。另外,一般的胶原酶消化法获取细胞时,胶原酶对细胞的伤害较大,培养出来的细胞状态差。

       贴块方法培养脐带间充质细胞是普遍采用的方法,但是,细胞从组织中爬出来的时间长(10-20天,甚至更长)。我们经过不断的摸索,找出一个用胶原酶消化获取脐带间充质干细胞的方法。
       具体操作方法如下:
       ① 在剪断连接婴儿端和母亲的脐带后,立刻用脐带夹夹住,防止内部污染。装入无菌袋(容器)中,送进实验室。
       ② 在生物安全柜或超净工作台内,取出脐带,连同脐带夹用75%的酒精泡2min(50ml离心管或250px皿)。如果脐带较长,无法装入容器,可以把脐带剪成250px左右,但是剪断之前一定要用脐带夹加好,防止酒精进入脐带内部,损伤细胞。
       ③ 用酒精处理完,迅速移入装有PBS或生理盐水的容器中浸泡清洗2次,每次2min即可。
       ④ 剪掉脐带夹,把脐带剪成2-75px段,用剪刀从脐静脉内侧剖开脐带,用带齿镊子(脐带组织比较滑,用带齿镊子好操作)把脐静脉、脐动脉以及脐带包膜去除,防止杂细胞混入。
       ⑤ 用剪刀剪碎脐带组织,0.1%Ⅱ型胶原酶(稀释液用DMEM/F12)过夜消化,4℃过夜消化。
       ⑥ 第二天,把未消化完的组织倒到100目(80目、160目都可以)的钢制筛网上(最好是钢制网筛,承载的组织量大,便于操作),用PBS(或生理盐水)多次冲洗,尽可能去掉附着在组织表面上的胶原酶。最后用完全培养基冲洗1-2次,去除PBS(或生理盐水)。
       ⑦ 倒入皿中(放入瓶中操作不方便),在未消化组织块上加入少量培养基培养(6ml加2-3ml、10ml加3-4ml)(其目的是减少残存胶原酶对细胞的伤害)。次日,组织块完全消失(被浸入到组织中的胶原酶消化掉了),细胞完全被分散开,显微镜下可以看到已经消化完的组织中有许多被分散的细胞。再加入少量培养基(150px加2-3ml、250px加4-5ml)加入培养基后继续培养。
       ⑧ 两天后继续添加少量培养基(150px加2-3ml、250px加4-5ml)培养。
       ⑨ 一两天后,细胞数量会有明显增加(许多成集落生长),分别移入两个50ml离心管中,加入PBS(或生理盐水)至50ml,混匀,2500rpm、6min离心。
      ⑩ 用5-6ml(根据细胞量)完全培养基重悬,1000rpm、6min离心,铺到T25瓶中,加入5ml完全培养基培养。

       三天后,可以换液或添加3-4ml完全培养基继续培养。之后每三天换液,直至长满(70%以上即可传代)

        启示与注意事项:
       ① 此方法具有易于操作,培养时间短的特点。
       ② 用胶原酶消化脐带,37℃下,数小时以内基本能够把脐带消化完,但同时对细胞的伤害较大。胶原酶能够浸透到脐带组织内部,低浓度的胶原酶从内到外消化组织,对细胞伤害较小。(胰蛋白酶对脐带组织消化效果非常差)
      ③ 彻底消化完组织,并没有单独把细胞分离出来的原因,是脐带胶原成分(粘稠)会促使脐带间充质干细胞增殖。多数细胞悬浮在胶原当中,以集落方式增殖,这是铺到瓶中,细胞保持良好状态的主要原因。
       ④ 培养脐带间充质干细胞时,不要用带有血清的培养基(血清会促进细胞分化),而是用干细胞专用培养基。传代也尽量不用胰蛋白酶消化(胰蛋白酶对脐带间充质干细胞伤害大),应该采用专用消化液,能够保证细胞更多的传代次数。