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NK 细胞因子法体外培养的方法

发布时间:2018-09-04 08:56 点击次数:

Nk 细胞又称自然杀伤细胞,是人体内抗癌活性最强的免疫细胞之一,它在骨髓中发育成熟后,主要存在于外周血、肝脏、腹膜腔和胎盘中,在遇到肿瘤病变细胞时就会把它们杀死,同时也会刺激身体产生抗肿瘤的免疫反应,所以被医学界称为「抗癌的第一道防线」。
NK 细胞主要分布于外周血,占外周血淋巴细胞总数的 5-10%,无需抗原提呈细胞作为中介提呈抗原,也无需抗体帮助,可直接清除衰老细胞、变性细胞、癌细胞及病毒感染细胞等。NK 细胞属于白细胞的一种,它是人体忠诚的卫士,主要任务就是消灭那些已经被病毒感染的细胞,从而把病毒消灭在「摇篮」中。另外,身体里面的肿瘤细胞也是它们追杀的对象。
NK 细胞在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起到非常重要的作用,是一种有效、安全的肿瘤生物免疫治疗方法,具有广阔的应用前景。

分离培养 NK 细胞有多种方法,以下是采用某种试剂盒的因子法体外培养方法来培养 NK 细胞:
这种方法采用自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞,经体外操作使 NK 细胞扩增活化,通过激活体 内特异性免疫反应达到杀火肿瘤细胞目的的一种体细胞治疗方法。

1. 某 NK 细胞培养试剂盒包含:
①无血清培养基 2 瓶(l000 mL/瓶):
②NK 试剂 A, 1 支:
③NK 试剂 B, 1 支:
④NK 试剂 C, 1 支:
⑤NK 试剂 D, 1 支:
⑥NK 试剂 E, 1 支:
培养体系中需用到 2 支(100 万 IU/支)rH IL-2

2. 原材料
1. 采取外周血(可从脐血、骨髓等组织)
2. 需的试剂耗材包括:
0.4% 苔盼蓝溶液、生理盐水、人淋巴细胞分离液(建议选用 GE)、175 cm²培养瓶、GT-T610(A)培养袋、15ral/50 ml/250 ml 离心管、移液管、1 毫升无菌注射器

3.NK 细胞培养时间过程:
前一天:要提前处理好细胞活化瓶(NK 试剂 A)
第 1 天:进行外周血单个核细胞分离与诱导 (NK 试剂 B)
第 3 天:NK 细胞第一次补液,补液 50 ml(NK 试剂 C)
第 5 天:NK 细胞第二次补液,补液 175 ml (NK 试剂 D)
第 7 天:NK 细胞第三次补液,装袋并补液 500 ml (NK 试剂 E)
第 9-10 天:NK 细胞第四次补液,分袋并补液 750 ml 
第 12 天:NK 细胞第五次补液. 补液 500 ml 
第 13 天:检菌
第 14、15 天:培养成功
(细胞培养成功时间视具体细胞生长情况而定,在保持培培养基 ph 和细胞活力正常的情况下也可以多培养一天)

4. 具体操作步骤如下:
1. 头一天一定要先处理细胞活化瓶。
2. 将 NK 试剂 A(4 度保存)加入到含有 12.5 ml 生理盐水的 175 cm²底面积细胞培养瓶中,充分的混匀 30 秒-1 分钟, 使液体充分在瓶底分散,4 度冰箱平放过夜。

(NK 试剂 A 需要和生理盐水充分混匀平铺在瓶底;次日取出后直接吸弃液体即可,无需清洗)

3. 外周血单个核细胞分离与诱导(第 1 天)
4. 以 100 ml 外周血为例,如血量不同,也可按操作规程做相应调整。
5. 将患者外周血,用移液讶吸取少许原血(约 300 ul)划线或滴入平皿过行检菌。然后,正常室温下, 进行离心。
6. 将上层血浆转入离心,灭活,离心,取上清液备用。
7. 使用等体积的生理盐水与血细胞沉淀混匀后,小心加到 Ficoll 层上,使分层保持清晰。室温内进行离心。
8. 吸取外周血单个核细胞 (PBMC)层,尽量吸尽两液面交接处的细胞层. 加生理盐水吹打混匀,离 心。相同方法冉次洗涤细胞。
9. 弃去上清后,用无血清培养基重悬细胞, 吸取少量细胞计数。
10. 按照细胞密度为 1-2*10^6 个/ml(最优为 5 *10^6 个/ml), 用培养基清洗离心管,并入培养瓶内,并加入 1 支 NK 试剂 B,患者灭活血浆 1.25 ml (5%)确保培养基终体积为 25 ml 左右。剩余血浆 4°C 密封保存备用。
注:包被瓶取出时间为细胞加入前 5 分钟, 其他时间需在 4 度放置备用。
试剂 A、B、C、D、E 的取用. 違议第一次吸取原液后. 以适貴培养基冲洗西林瓶后再吸出,以最大程度减少损耗。
11. 活化培养基的配置:其中 1 瓶无血清培养基中,加入 100 万 IU 的 IL-2,终浓度为 1000IU/mL。
注:活化培养基每次使用前恢复至室温。
12.NK 细胞的第一补液(第 3 天),补加含有 5% 的患者灭活血浆和 NK 试剂 C,确保培养的终体积为 75 mL。(请勿吹打细胞)
13.NK 细胞的第二次补液(第 5 天),补加含有 5% 的患者灭活血浆和 NK 试剂 D, 确保培养的终体积为 250 ml.(请勿吹打细胞)
14.NK 细胞的第三次补液及其装袋(第 7 天),细胞转袋前将培养瓶底部的细胞进行轻微吹散细胞,切勿剧烈吹打,随后将培养瓶的中的细胞悬液及其 500 mL 活化培养基,装入到细胞培养袋中,同时加入 1 支 NK 试剂 E,及其剩余的全部血浆,确保终体积为 750 ml。
15.NK 细胞的第四次补液(第 9 天),主要为分袋操作,将培养体系由 750 ml 扩增至 1500 ml。
16.NK 细胞的第五次补液(第!2 天). 主要为补液操作,将剩余的 500 mL 扩增液均分到 2 个培养袋中,确保每袋体积为 1000 ml。
17. 检菌,细胞培养第 13 天,对细胞悬液进行检菌、内毒素检测。用 5 ml 注射器分别从培养瓶和袋内抽取少最细胞悬液,加入正置的平皿中,放入 35℃ 恒温生化培养箱, 记录放入日期及培养物品。隔夜后倒置,保留 48 小时。
18. 收获,正常情况下,第 13, 14 天各收获 1000 ml 细胞悬液。若因临床需要进行提前或延迟回输,也可相应提前或延迟。(NK 细胞建议 2-4 h 之内使用,以保证其活性)